Architecture variable des microtubules chez le parasite du paludisme

Nature Communications volume 14, Numéro d'article : 1216 (2023) Citer cet article

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Les microtubules sont un élément cytosquelettique eucaryote omniprésent composé généralement de 13 protofilaments disposés dans un cylindre creux. Cet arrangement est considéré comme la forme canonique et est adopté par la plupart des organismes, à de rares exceptions près. Ici, nous utilisons la cryo-tomographie électronique in situ et la moyenne des sous-volumes pour analyser l'évolution du cytosquelette de microtubules de Plasmodium falciparum, l'agent causal du paludisme, tout au long de son cycle de vie. De manière inattendue, différentes formes de parasites ont des structures de microtubules distinctes coordonnées par des centres d'organisation uniques. Chez les mérozoïtes, la forme la plus étudiée, on observe des microtubules canoniques. Dans les formes de moustiques migrateurs, la structure à 13 protofilaments est encore renforcée par des hélices luminales interrompues. De manière surprenante, les gamétocytes contiennent une large distribution de structures de microtubules allant de 13 à 18 protofilaments, doublets et triplets. Une telle diversité de structures de microtubules n'a été observée dans aucun autre organisme à ce jour et est probablement la preuve d'un rôle distinct dans chaque forme de cycle de vie. Ces données fournissent une vue unique sur un cytosquelette de microtubules inhabituel d'un agent pathogène humain pertinent.

Les microtubules sont un composant vital du cytosquelette dans toutes les branches des eucaryotes, formant des pistes pour le transport intracellulaire, un support structurel pour la locomotion et des fuseaux pour la ségrégation des chromosomes. La polymérisation des hétérodimères α-/β-tubuline forme des protofilaments qui interagissent latéralement pour s'assembler en un cylindre creux. Le microtubule à 13 protofilaments est considéré comme canonique car cette structure a été le plus souvent observée au sein de supergroupes eucaryotes largement étudiés. Alors que les premiers microscopistes électroniques ont trouvé plusieurs exemples de microtubules non canoniques1, la difficulté de purifier la tubuline native fonctionnelle de certaines espèces et la dépendance excessive à l'égard d'organismes modèles ont fait que notre compréhension de la biologie des microtubules repose principalement sur l'étude des microtubules métazoaires. Des exemples non canoniques, tels que les microtubules à 11 protofilaments de cellules spécialisées chez les nématodes2,3 et les microtubules à 15 protofilaments de cellules piliers de l'oreille interne4,5, sont considérés comme de curieuses valeurs aberrantes. Le résultat est que, bien que les protozoaires forment un groupe important et diversifié, la plupart de nos hypothèses sur leurs microtubules ont été déduites d'études sur les métazoaires.

Les parasites protozoaires eucaryotes de Plasmodium spp. reposent sur un échafaudage de microtubules sous-pelliculaires ordonnés (SPMT) comme principaux composants structurels du cytosquelette. P. falciparum, l'agent causal du paludisme, a un cycle de vie complexe alternant entre le moustique vecteur et l'hôte humain (Fig. 1). Une coévolution étendue avec les deux hôtes a entraîné l'utilisation par l'agent pathogène d'une multitude de types de cellules hautement spécialisées et morphologiquement distinctes, appelées ici formes. Bien que chaque forme soit maîtresse d'une niche distincte et morphologiquement variée, la présence des SPMT est un trait fédérateur. Les SPMT se trouvent en dessous et interagissent avec une double membrane connue sous le nom de complexe de membrane interne (IMC) située sous la membrane plasmique. Ensemble, ces structures sont appelées la pellicule qui se trouve à travers Apicomplexa, y compris, par exemple, Toxoplasma gondii. La pellicule est décomposée en transition puis reconstruite au cours de la maturation de chaque forme du cycle de vie, et à chaque fois elle est accompagnée d'un ensemble différent de protéines associées6,7. Cette réorganisation de novo est un moteur des changements morphologiques substantiels du parasite et les SPMT jouent un rôle clé dans ce processus8.

a Cycle de vie simplifié de Plasmodium des formes parasitaires étudiées ici. Les sporozoïtes sont injectés dans l'hôte. Après différenciation dans le foie, les mérozoïtes sont libérés dans le sang. La majorité entre dans un cycle de réplication asexuée (mérozoïtes) et un petit pourcentage s'engage à devenir des gamétocytes. Les gamétocytes sont absorbés par un moustique et après fusion des gamètes mâles et femelles dans l'intestin du moustique, les zygotes se transforment en ookinètes. Les ookinètes traversent l'intestin moyen du moustique, se transforment en oocystes et forment des milliers de sporozoïtes, qui migrent vers les glandes salivaires. b Représentation schématique de notre flux de travail : (i) les parasites vivants sont vitrifiés sur des grilles EM. (ii) les cellules sont amincies en lamelles puis (iii) imagées par cryo-tomographie électronique (cryo-ET). Les séries d'inclinaison sont collectées et reconstruites par calcul en volumes 3D. c Colonnes 1 à 4 : images représentatives des parasites à différentes étapes du flux de travail. 1 : compositions d'images de fluorescence de cellules mettant en évidence la forme globale du parasite. En médaillon : représentation cartoon de chaque étape. 2 : Micrographies au microscope électronique à balayage (MEB) montrant des parasites Plasmodium (certains présentant une fausse coloration jaune et verte) entourés de cellules hôtes (astérisques verts). 3 : micrographies montrant des aperçus de lamelles. 4 : coupes à travers des exemples de tomographies.

Bien que les tubulines eucaryotes soient hautement conservées, il existe des différences appréciables qui font ressortir les microtubules apicomplexes. Les SPMT du parasite sont extrêmement stables, résistantes à la plupart des protocoles de dépolymérisation classiques tels que les traitements par le froid9, l'ajout de médicaments dépolymérisants des microtubules10 et les détergents11,12. Une autre caractéristique unique de la tubuline apicomplexe est sa formation de semi-tubules en forme de L qui, avec des protéines accessoires, forment une structure hélicoïdale appelée conoïde13,14. Le conoïde est une structure spécialisée impliquée dans l'invasion. Bien que caractérisés chez Toxoplasma, des homologues de certains composants conoïdes sont exprimés chez Plasmodium spp.15.

Les microtubules assemblés in vitro, à partir de tubuline purifiée, sont constitués de 9 à 16 protofilaments, avec des distributions différentes du nombre de protofilaments selon les espèces et les conditions utilisées1,16. Comme ces variations ne se trouvent normalement pas dans les cellules, la stipulation d'une population de microtubules uniformément à 13 protofilaments doit donc être établie lors de la nucléation par des facteurs externes. Il existe quatre mécanismes communs pour contrôler le nombre de protofilaments dans un microtubule : la modélisation via le complexe de l'anneau γ-tubuline (γTuRC)17,18, la définition d'un angle inter-protofilament spécifique par la liaison latérale de protéines telles que la doublecortine19,20, l'expression de différentes isoformes de tubuline21 ou modifications post-traductionnelles22. Chez les métazoaires, la nucléation des microtubules se produit généralement au niveau des centrosomes (centres d'organisation des microtubules, MTOC). Dans les formes invasives de parasites apicomplexes, un MTOC structurellement diversifié situé à leur extrémité apicale, l'anneau polaire apical (APR), coordonne le contrôle spatial d'ordre supérieur des SPMT23, mais le mécanisme spécifique reste inconnu.

Pour visualiser directement la diversité des microtubules dans Plasmodium spp, nous imaginons quatre formes de cycle de vie de parasites différentes dans des conditions natives en utilisant le broyage par faisceau d'ions focalisé cryogénique (FIB), la tomographie électronique (cryo-ET) et la moyenne des sous-volumes (SVA) (Fig. 1 ). En révélant ces structures dans leur contexte natif, en 3D, nous découvrons une architecture cytosquelettique inhabituelle, où chaque forme de parasite a une structure de microtubule distincte et spécialisée, certaines étant sensiblement différentes du microtubule canonique.

Pour déterminer les structures in situ des microtubules dans différentes formes de Plasmodium, nous avons effectué un broyage FIB et une cryo-ET sur deux moustiques (sporozoïtes et ookinètes) et deux formes humaines (mérozoïtes et gamétocytes, Fig. 1). Nous avons effectué un broyage FIB ciblé (Fig. 1b) pour produire des lamelles d'épaisseurs comprises entre 50 nm et 300 nm aux endroits contenant des parasites. Initialement, la microscopie optique et électronique corrélative (CLEM) a été utilisée pour identifier les parasites vitrifiés sur des grilles EM. Nous avons découvert plus tard que leurs formes distinctives dans SEM (Fig. 1c, colonne 2) permettaient un ciblage sans corrélation. Pour chaque étape, nous avons acquis entre 50 et 100 tomogrammes d'environ 20 lamelles, pour obtenir une bonne couverture des différentes régions subcellulaires. Nous avons effectué une sélection manuelle afin d'effectuer une SVA de manière exhaustive sur tous les microtubules, générant ainsi des modèles ultrastructuraux complets et permettant une analyse statistique. Pour éviter les biais potentiels, tous les ~ 850 microtubules individuels de l'ensemble de données ont été analysés indépendamment avec SVA. Cela nous a permis d'étudier la variabilité structurelle, y compris le nombre de protofilaments et la polarité relative24, à la fois au sein de chaque cellule et entre les quatre formes de cycle de vie.

Nous avons commencé notre étude par l'imagerie de formes parasitaires isolées du moustique vecteur : sporozoïtes et ookinètes. Ces formes mobiles sont allongées avec un échafaudage SPMT dense sous l'IMC. À première vue, la lumière des SPMT dans les sporozoïtes et les ookinètes contenait une (pseudo-) densité hélicoïdale avec une périodicité d'environ 8 nm, ce qui correspond aux prédictions précédentes (Fig. 2, 3)11. Pour générer des cartes de densité EM impartiales, 422 SPMT de sporozoïtes et 177 ookinetes ont été analysés par SVA sans appliquer de (pseudo-)symétrie. Les deux structures résultantes montraient des microtubules à 13 protofilaments avec des hélices luminales interrompues deux fois (Figs. 2b – d, 3c). Des structures similaires, appelées Interrupted Luminal Helices (ILH), ont d'abord été observées dans les extrémités flagellaires des spermatozoïdes humains25, et plus récemment dans les spermatozoïdes équins et porcins26, et les tachyzoïtes de Toxoplasma gondii14,27. Nous avons adopté la nomenclature de Zabeo et al25. L'ILH de T. gondii est constituée des protéines 1 et 2 de type thiorédoxine (TrxL1, TrxL2) et de la protéine 1 des microtubules sous-pelliculaires (SPM1). Nous avons émis l'hypothèse que l'ILH dans Plasmodium et Toxoplasma consiste probablement en des protéines homologues : premièrement, Plasmodium spp. ont des homologues de TrxL1 (PfTrxL1) et SPM1 (PfSPM1) mais manquent de TrxL2, qui dans le Toxoplasma ILH est présent dans les deux, et remplit complètement l'une des deux interruptions. De manière constante, nous avons exclusivement observé des hélices luminales interrompues deux fois chez Plasmodium. Deuxièmement, compatible avec le fait que l'ILH soit composé de SPM1 et TrxL1 dans Plasmodium, nous avons constaté une forte expression dans Plasmodium berghei (Pb) de PbSPM1-GFP et PbTrxL1-GFP dans nos lignées de sporozoïtes marquées de manière endogène (Fig. S2). Enfin, Plasmodium et Toxoplasma TrxL1 et SPM1 sont hautement conservés12 (Fig. S1a, b), et le modèle d'assemblage SPMT de T. gondii (pdb 7MIZ) s'intègre bien dans nos cartes EM (Fig. 2c, d). En raison de la nature asymétrique de l'ILH, il n'y a qu'une seule façon d'adapter la structure ILH de T. gondii à la densité EM des SPMT Plasmodium. Nous suggérons donc que P. falciparum ILH se compose de 10 copies de PfTrxL1, probablement avec un nombre équivalent de PfSPM1 séparés en deux demi-croissants (Fig. 2c). Cela nous a également fourni une méthode fiable pour identifier à la fois la position de la couture et l'emplacement de la tubuline alpha-bêta dans notre structure (Fig. 2c, d).

une tranche à travers un tomogramme illustrant l'architecture globale de la pellicule dans une cellule. On voit un SPMT entrer et sortir du plan de coupe. Encarts : tranches à travers la carte EM (illustrée en B, C, D) replacées dans le tomogramme à des positions déterminées par SVA. b Coupes orthogonales à travers la carte EM. c Représentation isosurface de la carte EM avec modèle pseudoatomique (7MIZ) ajusté à la densité EM. p1-p13 = nombres de protofilaments, ligne pointillée = position de la couture. d En haut : section de la carte EM montrant la position d'un dimère de tubuline α/β par rapport à TrxL1. En bas : projection radiale avec une période de l'ILH surlignée en violet. e Le pôle apical d'un sporozoïte de P. falciparum avec un ensemble complet de microtubules (13 bleus + 1 vert). L'APR est représenté par une isosurface, les SPMT comme modèles de broches, où la tête d'épingle marque le centre et la ligne est orientée vers la couture. f Pôle apical du sporozoïte segmenté. La densité de tubuline (13 protofilaments) de deux SPMT a été cachée pour révéler l'ILH. Coupe non annotée à travers le tomogramme illustré à la Fig. S3a et le volume complet dans le film supplémentaire S1.

une tranche de tomogramme à travers l'extrémité apicale d'un ookinete avec des SPMT orientés le long de l'axe apico-basal. Un dessin animé d'un ookinete sur la droite montre les positions centrales approximatives des lamelles en a, b et d. b Couper à travers une région proximale de l'apex de l'ookinète avec des SPMT coupés transversalement, les couleurs d'annotation sont les mêmes qu'en a. Les SPMT se rapprochent de l'IMC au fur et à mesure que le collet apical interne se rétrécit (de gauche à droite). L'orientation de rotation des SPMT (du centre à la couture) est indiquée par des flèches. c Sections orthogonales à travers la carte EM déterminée par SVA des SPMT ookinete. d Segmentation d'une région proximale de l'apex d'un ookinète avec des SPMT coupés transversalement, mettant en évidence les deux couches de collier apical entre les SPMT et l'IMC. Le conoïde est représenté en vert. e Segmentation du pôle apical d'un ookinete. La densité de tubuline d'un SPMT a été masquée pour révéler l'ILH. L'encart montre une coupe à travers un volume moyen de la structure périodique du conoïde. Coupe non annotée à travers le tomogramme illustré à la Fig. S3b et volume complet dans le film supplémentaire S2.

Bien que la plupart des structures de microtubules résolues à ce jour soient presque circulaires en coupe transversale, les microtubules de Plasmodium avec ILH et, dans une moindre mesure, les microtubules de T. gondii avec ILH (Fig. S1c, d) sont aplatis le long d'un axe imaginaire à peu près entre les protofilaments 2 et 9. Cela implique que l'ILH stabilise l'angle inter-protofilaments à ~ 26 °, s'écartant de ~ 2 ° des 27, 7 ° théoriques des microtubules canoniques à 13 protofilaments (Fig. S1c, d). L'écart par rapport à la section transversale circulaire s'accumule sur 5 sous-unités et est ensuite compensé par un angle relatif de 37° entre les protofilaments 6 et 7, et 12 et 13. Les comparaisons de la structure prédite de Plasmodium's TrxL1 à celle de T. gondii ont montré que le plus grand la différence se situe au niveau de l'hélice N-terminale (Fig. S1e), qui est responsable d'une grande partie de l'interface sous-unité-sous-unité et peut jouer un rôle dans l'ellipticité accrue.

À l'extrémité apicale de l'ookinete, nous avons observé une structure cohérente avec un conoïde classique constitué d'une structure de tubuline unique (N = 1, Fig. 3e). La section transversale de volume moyen est cohérente avec le conoïde à base de tubuline en forme de L décrit chez T. gondii14. Le conoïde ookinete mesurait 70 nm de hauteur et 300 nm de diamètre, ressemblant à un état rétracté. Jusqu'à récemment, on pensait que Plasmodium (appartenant à la classe Aconoidasida, c'est-à-dire sans conoïde) ne possédait pas de conoïde. Nos données valident la génétique précédente, la microscopie à fluorescence et les données EM classiques faisant allusion à la présence d'une structure de type conoïde à l'apex de l'ookinete15,28.

Sur la base de nos données sur la forme des moustiques et des structures récentes de T. gondii, il semblait plausible que l'ILH soit une caractéristique omniprésente des microtubules apicomplexes. Pour vérifier qu'il s'agit d'une caractéristique universelle dans toutes les formes de cycle de vie, nous avons ensuite analysé les formes de P. falciparum de l'hôte humain. De plus, pour évaluer si la présence d'un ILH est spécifique aux SPMT ou à un composant général des microtubules, nous avons imagé à deux moments du développement des schizontes. Pour les SPMT, nous avons imagé des schizontes entièrement segmentés (mérozoïtes), tandis que pour les microtubules de fuseau, nous avons visé à diviser les schizontes. Le stade sanguin asexué, le mérozoïte, qui sort d'un schizonte mature, est une petite cellule avec seulement deux à trois SPMT (Fig. 4). Les mérozoïtes sont de courte durée; pour éviter l'imagerie des cellules non viables, nous avons bloqué les schizontes avant la sortie à l'aide d'un inhibiteur de protéase bien caractérisé (E64) 29, entraînant des mérozoïtes dans les sacs à membrane érythrocytaire.

a Tranche à travers un tomogramme d'un pôle apical. En médaillon : coupe à travers la moyenne du sous-volume des microtubules montrant 13 protofilaments. b Segmentation d'un noyau dans un schizonte en division avec un corps de fuseau partiel. Les quatre complexes de pores nucléaires observés dans cette section du noyau sont à proximité du fuseau. En médaillon : coupez à travers une isosurface de la carte SPMT EM. c Segmentation d'un seul mérozoïte dans un schizonte entièrement segmenté. Remarque : pour simplifier, l'IMC est segmenté comme une double membrane continue bien que de multiples discontinuités aient été observées. Coupe non annotée à travers le tomogramme illustré à la Fig. S3c et volume complet dans le film supplémentaire S3.

De manière inattendue et contrairement aux formes de moustiques, il n'y avait pas d'ILH dans les SPMT mérozoïtes (Fig. 4a, c). L'analyse par SVA a montré que les SPMT des mérozoïtes sont canoniques, c'est-à-dire constituées de 13 protofilaments. De même, les microtubules du fuseau des schizontes en division étaient canoniques et manquaient d'ILH (Fig. 4b). Cependant, contrairement aux SPMT qui n'étaient pas coiffés, les microtubules du fuseau contenaient une densité de coiffage à leurs extrémités négatives qui ressemblait à γTuRC (Fig. S4c) 30 . Cela indique que les structures du cytosquelette des microtubules de Plasmodium sont modifiées en fonction du stade du cycle de vie et que différentes populations de microtubules peuvent être nucléées par des mécanismes distincts.

Après avoir révélé que les structures des microtubules sont différentes entre les formes de moustiques et les formes sanguines de mérozoïtes asexués, nous avons ensuite entrepris d'étudier les SPMT dans les gamétocytes sexuels. Le gamétocyte de P. falciparum se développe d'une forme ronde à une forme allongée et finalement falciforme à travers cinq stades morphologiques. Les SPMT commencent à polymériser au stade II et au stade IV, ils entourent complètement le cytoplasme. Nous avons enrichi les gamétocytes à différentes étapes du processus de maturation et étudié leurs microtubules.

La couverture de la pellicule a augmenté avec les stades de développement ultérieurs et avec elle le nombre de SPMT dans chaque cellule. À tous les stades des gamétocytes, les sections transversales SPMT avaient des diamètres sensiblement grands et variables, allant de 27 à 37 nm, et consistaient en un mélange de singulets, de doublets, de triplés (souvent avec des géométries inhabituelles) et même d'un quadruplet (Figs. 5, S5 ). Ceci était inattendu car dans tous les organismes étudiés à ce jour, les microtubules cytoplasmiques sont des tubes uniques (microtubules singulets) et des études antérieures ont rapporté des microtubules de plus petit diamètre31. Des doublets (canoniquement constitués de 13 + 10 protofilaments) et des triplets se trouvent dans les cils et les flagelles26,32, les triplets étant les caractéristiques des centrioles. Conformément aux SPMT mérozoïtes, nous n'avons trouvé aucune preuve d'un ILH dans ces microtubules géants. La SVA a été réalisée indépendamment sur chacun des ~ 170 tubules singulet et ~ 30 tubules A des SPMT doublet et a étonnamment montré qu'ils se composaient de 13, 14, 15, 16, 17 ou 18 protofilaments (Fig. 5c, Tableau S1). Bien que certains microtubules canoniques soient présents, ceux-ci ne représentaient que 9 % de la population, tandis que les microtubules à 17 protofilaments étaient les plus fréquents (40 %) (Fig. 5c). Les doublets étaient également géants et leurs tubules A avaient une distribution similaire, 17 protofilaments étant les plus courants (Fig. S5b, c). Étonnamment, compte tenu de l'omniprésence d'un tubule A à 13 protofilaments dans d'autres organismes, il n'y avait pas de tubules A à 13 protofilaments. La diversité du nombre de protofilaments distingue clairement la population SPMT de gamétocytes de toutes les autres formes. Que cela soit dû à une nucléation SPMT spécifique aux gamétocytes ou à un mécanisme différent pourrait être étudié par comparaison avec les microtubules dans d'autres compartiments cellulaires.

a Micrographie montrant une rangée de sections transversales SPMT singulet et doublet et mettant en évidence la gamme de tailles. Les numéros de protofilament sont indiqués (pour les doublets du tubule A). Des micrographies à deux angles d'inclinaison différents ont été cousues pour montrer des vues transversales SPMT. b Segmentation d'un noyau de gamétocytes de stade III avec un corps polaire fusiforme au niveau d'un complexe de pores nucléaires. Les couleurs des microtubules correspondent aux nombres de protofilaments comme indiqué dans c, dc Diagramme à barres de la distribution des différents nombres de protofilaments dans les SPMT (bleu) N = 155 et les fuseaux nucléaires (lilas) N = 31. Les distributions sont significativement différentes (p = 5 × 10− 8, chi carré). d Isosurfaces des microtubules du sous-volume en moyenne avec des nombres de protofilaments de 13 à 18. e Représentation schématique des différences de diamètre des microtubules. f Segmentation d'un gamétocyte de stade III avec des SPMT en coupe transversale. Les couleurs des microtubules correspondent aux numéros de protofilaments comme indiqué en c, d. '+/−' indique la polarité de chaque microtubule. Coupe non annotée à travers le tomogramme illustré à la Fig. S3d et volume complet dans le film supplémentaire S4.

Outre les SPMT, il existe deux autres populations de microtubules dans les gamétocytes : le fuseau nucléaire (ou hémi-fuseau33) et le cytoplasmique. Les microtubules cytoplasmiques ont une durée de vie courte et n'apparaissent que dans les gamétocytes à un stade précoce du côté opposé de la cellule par rapport à la pellicule en développement34. Par conséquent, les microtubules cytoplasmiques sont relativement rares. Nous avons observé un mélange de nombres de protofilaments (13 à 16, Fig. S5e) et bien qu'il y ait eu une indication de regroupement par taille de protofilament, cela n'a pas pu être confirmé en raison du faible nombre. Des microtubules nucléaires ont été fréquemment observés chez les parasites de stade III / IV des gamétocytes et un corps polaire de fuseau complet était présent dans une tomographie (Fig. 5b). Les microtubules de fuseau variaient de 13 à 17 protofilaments, 15 étant les plus courants (Fig. 5b, c). Ceci était inattendu car, quel que soit le nombre de protofilaments, toutes les extrémités négatives étaient clairement coiffées d'une structure qui pourrait être γTuRC (bien qu'elle soit aplatie par rapport à la forme canonique). Notamment, γTuRC a, jusqu'à présent, été exclusivement décrit dans les microtubules canoniques (Fig. S4d). Ensemble, ces données suggèrent que la large distribution des nombres de protofilaments peut être le résultat d'une expression différentielle d'isoformes ou d'une modification post-traductionnelle, plutôt que d'un mécanisme de nucléation.

Après avoir observé des différences structurelles substantielles entre les populations de microtubules entre les quatre formes individuelles, nous avons concentré notre analyse sur les assemblages apicaux où se produit la nucléation des SPMT. Dans les formes parasitaires invasives (mérozoïtes, sporozoïtes et ookinètes), les anneaux protéiques (APR) au pôle apical agissent comme des MTOC uniques, coordonnant les SPMT en plus de terminer l'IMC. Conformément à cela, tous les SPMT sous les formes de moustiques et de mérozoïtes avaient la même polarité, avec leurs extrémités négatives au pôle apical et leurs extrémités positives atteignant le pôle cellulaire basal. Dans toutes les formes invasives, leurs extrémités négatives étaient émoussées et dépourvues de capuchon γTuRC, bien qu'il puisse y avoir des protéines associées aux microtubules (MAP) supplémentaires dans la lumière des extrémités négatives de l'ookinete (Fig S4a). Cependant, malgré les trois formes contenant des SPMT à 13 protofilaments avec la même polarité, il y avait des différences à grande échelle dans l'architecture de leurs pôles apicaux (Figs. 2–4).

L'apex du mérozoïte était le plus simple, avec seulement deux à trois microtubules rayonnant de l'APR (Fig. 4c). Plutôt que d'être répartis également autour de l'APR, tous les SPMT sont originaires du même côté de l'anneau. Les sporozoïtes contenaient un plus grand nombre de SPMT. Dans deux tomographies, nous avons pu voir des APR de sporozoïtes complets avec un ensemble complet de 13 étroitement espacés et un seul SPMT opposé (Figs. 2e, f, S6). Les extrémités négatives du SPMT étaient en contact direct apparent (Fig. S6a) et au ras du bord apical de l'APR. Cependant, chaque SPMT avait un angle d'attaque différent par rapport à l'axe de symétrie de rotation de l'anneau qui est incliné d'environ 45 ° 35 par rapport à l'axe apico-basal du parasite (Fig. S6c, d). Le contact SPMT-APR doit donc permettre une grande flexibilité. En revanche, l'orientation radiale du SPMT était contrainte, les protofilaments 6 à 9 étant préférentiellement en contact avec l'APR (Fig. S6c).

L'apex le plus élaboré a été observé chez les ookinètes, avec deux couches concentriques de protéine amorphe, plutôt qu'un seul anneau (Fig. 3). En raison de la grande différence de morphologie, nous privilégions le terme collier apical (AC)15, mais APR est également approprié en raison de la similitude fonctionnelle. Les deux anneaux se sont séparés en tentacules sur leur côté basal (Fig. 3b, d, e), l'AC interne étant en contact direct avec et suivant les SPMT individuels jusqu'à ~ 1 µm. Pour s'adapter au grand nombre de SPMT présents sous cette forme (~ 50–60) dans l'extrémité apicale étroite, les extrémités négatives des microtubules provenaient de positions décalées à partir du bord apical AC (Fig. 3e).

Les cellules de gamétocytes n'ont pas de polarité cellulaire claire, contrairement aux cellules nettement polaires des trois formes invasives décrites ci-dessus (Figs. 2–4). Nous n'avons observé aucune preuve d'une structure de type APR ou d'une autre structure qui pourrait agir comme un MTOC aux pôles des gamétocytes, et les SPMT sont originaires de positions apparemment non coordonnées le long de la cellule. Contrairement aux formes invasives où tous les SPMT avaient la même polarité avec des extrémités négatives à l'extrémité apicale, les SPMT des gamétocytes avaient une polarité aléatoire apparente (Fig. 5f, Tableau S1). De plus, il n'y avait aucun schéma perceptible dans la distribution des SPMT le long de l'IMC en ce qui concerne le nombre de protofilaments ou de tubules secondaires (Fig. 5f, Tableau S1). Considérant que les SPMT dans les trois formes antérieures n'avaient pas de capuchon γTuRC, nous avions initialement émis l'hypothèse que les facteurs de nucléation SPMT pourraient être physiquement associés à l'APR ou à l'AC. Cependant, une analyse ciblée des extrémités négatives du SPMT des gamétocytes a montré qu'elles étaient également non coiffées (Fig. S4). Ensemble, cela suggère un mécanisme de nucléation indépendant de γTuRC qui n'est pas uniquement associé à l'APR.

Bien que les parasites Plasmodium modifient leur structure de microtubules, les MTOC et l'organisation des microtubules d'ordre supérieur à chaque étape de leur cycle de vie, une caractéristique unificatrice est l'interaction des SPMT avec l'IMC. Pour déterminer si l'interaction SPMT-IMC est médiée de la même manière dans toutes les formes de parasites, nous avons mesuré la distance la plus courte (dIMC) entre la surface de chaque SPMT et la membrane IMC interne (Fig. 6). Un dIMC similaire dans toutes les formes de parasites suggérerait que les mêmes protéines sont impliquées dans l'attachement des SPMT à l'IMC. En excluant les assemblages apicaux, il n'y avait pas de différence significative dans le dIMC entre les quatre formes de parasites (avec une médiane commune de 18 nm et un écart type de 10 nm, Fig. 6d). Cette distance a augmenté au sommet de l'ookinete à ~ 50 et ~ 100 nm afin de s'adapter à l'AC, mais la distance entre la surface SPMT et la surface la plus proche, l'AC interne, était comparable à dIMC (~ 13 nm, Fig. 6a) . Ainsi, nous montrons que, bien que chaque étage ait une structure SPMT unique, la distance entre les SPMT et l'IMC reste cohérente entre les étages. Nous émettons donc l'hypothèse que les mêmes protéines lient les SPMT à l'IMC dans toutes les formes parasitaires analysées.

Panneaux a à c à gauche : diagrammes de dispersion de la distance SPMT individuelle (dIMC) et de l'orientation radiale (φIMC) par rapport à l'IMC. Chaque point représente la médiane le long d'un seul SPMT. Les SPMT d'ookinètes et de sporozoïtes ont une polarité définie alors que les orientations des gamétocytes sont aléatoires (voir Fig. S7 pour la représentation en histogramme 2D de ces données). Les caricatures de formes parasitaires indiquent les emplacements subcellulaires où les points de données ont été échantillonnés : au niveau du corps cellulaire ou de l'apex. À droite : volumes moyens de SPMT échantillonnés aux emplacements subcellulaires indiqués. Bien que la moyenne des sous-volumes se soit concentrée sur les SPMT, les composants IMC et APR peuvent être vus dans les cartes EM après l'extraction de grands sous-volumes (bords de 200 nm). Ceci est une conséquence de la distance et de l'orientation constantes du SPMT-IMC. Les dessins animés en dessous des volumes moyens sont des modèles de l'architecture de la pellicule à chaque emplacement. Notez que puisque l'IMC s'enroule autour du sporozoïte en forme de tore APR, il n'a pas été possible de mesurer un seul dIMC apical (les angles φIMC apicaux sont illustrés à la Fig. S6b). Le panneau de gamétocytes (c) montre des coupes à travers des SPMT individuels plutôt qu'une moyenne, pour indiquer leurs orientations incohérentes et un nombre différent de protofilaments. * Voir les documents supplémentaires pour les détails et les hypothèses formulées dans l'affectation de l'orientation des gamétocytes. d Graphique en violon comparant dIMC entre les formulaires, les largeurs sont mises à l'échelle en fonction de la quantité de données.

Avec l'hypothèse qu'un lieur commun relie les SPMT à l'IMC sous toutes leurs formes, et sachant que les SPMT sous forme de moustique ont une orientation radiale préférée (Figs. 2e, 3b, S6b, c, S7), nous avons entrepris de regarder pour le site de liaison du lieur. Un candidat clair, car il s'agit d'une caractéristique structurelle asymétrique distincte, était la couture. Nous avons mesuré l'angle, φIMC, entre la couture, le centre des microtubules et le point le plus proche sur la surface IMC (voir les informations supplémentaires pour plus de détails sur l'orientation de la couture).

L'analyse du φIMC moyen pour tous les SPMT possibles a révélé que seuls les SPMT au stade de moustique ont une polarité radiale définie. Étonnamment, la couture s'éloigne de l'IMC avec le protofilament 8 orienté vers lui à la place (Figs. 6a, b, S6, S7). Contrairement aux formes de moustiques, aucun regroupement de φIMC n'a été observé dans les gamétocytes, ce qui suggère que dans cette forme de cycle de vie, la protéine de liaison n'a pas de position de liaison spécifique (Fig. 6c).

Bien que ces résultats n'aient pas trouvé de site de liaison universel pour le lieur sur tous les SPMT, ils ont suggéré que l'ILH était impliquée dans la définition de l'orientation radiale par rapport à l'IMC. Nous avons inspecté la carte de densité SPMT EM du stade des moustiques à la recherche d'indices possibles. Même à des niveaux de contour bas, il n'y avait pas de densité de liaison entre le SPMT et l'IMC, ce qui indique que toute protéine de liaison est flexible ou présente à une faible occupation. Néanmoins, il y avait des preuves d'une décoration radialement asymétrique avec une densité de protéines inconnue entre les protofilaments 10, 11 et 12, avec une densité supplémentaire émanant radialement vers l'extérieur des protofilaments 11 et 12 (Fig. S8). Si ces densités correspondent à une partie du lieur SPMT-IMC, il faudrait probablement des connexions SPMT-IMC supplémentaires (éventuellement au protofilament 6 ou 7) pour établir l'orientation radiale observée du protofilament 8 pointant vers l'IMC. Ainsi, bien que les détails précis d'un lieur restent à élucider, nous présentons des preuves d'une décoration asymétrique et d'une polarité radiale, qui sont probablement dépendantes de l'ILH, dans les microtubules sous forme de moustique.

Le parasite P. falciparum a développé un cycle de vie complexe, se déplaçant à travers de multiples tissus différents au sein de son hôte humain et moustique vecteur. Pour chaque nouvelle niche environnementale, le parasite subit des changements morphologiques extrêmes. Au fur et à mesure que le parasite se transforme en de nouvelles formes spécialisées pour chaque niche, ses microtubules sont désassemblés puis réassemblés en plusieurs structures uniques et adaptées, coordonnées par des MTOC inhabituels (Fig. 7). Alors que l'extrémité apicale de l'ookinète est la plus élaborée et comprend un conoïde à base de tubuline, les gamétocytes se distinguent des autres formes par leur absence d'APR et leur population diversifiée de structures de microtubules (Figs. 5, 7).

a Représentations en dessins animés des quatre formes de Plasmodium analysées. b Tableau récapitulant les principales différences architecturales des quatre formes. Les contours pleins indiquent des propriétés qui sont probablement corrélées : la présence d'un anneau polaire apical définit la polarité SPMT et ILH est directement liée à la définition de l'orientation de la couture par rapport à l'IMC.

Les gamétocytes ont une large gamme et une grande variété de structures de microtubules, y compris des singulets avec 13 à 18 protofilaments et des doublets géants, des triplés et des quadruplés. Une telle diversité structurelle est jusqu'à présent sans précédent, ce qui soulève des questions sur le mécanisme sous-jacent et le rôle physiologique. Selon nos connaissances actuelles, le nombre de protofilaments est étroitement contrôlé, mais ce n'est apparemment pas le cas dans les gamétocytes. Les microtubules ont la propension à s'auto-assembler in vitro, bien qu'à des concentrations considérablement plus élevées que physiologiques. Cet auto-assemblage spontané se traduit par des populations de microtubules avec une large distribution du nombre de protofilaments (9 à 16 pour la tubuline de cerveau bovin)1,16. Cependant, il est peu probable qu'un auto-assemblage sans nucléation soit responsable des SPMT géants non canoniques dans les gamétocytes, car leur polymérisation est limitée à la surface des plaques IMC en croissance, plutôt que spontanément dans le cytoplasme. De plus, nous avons parfois observé des groupes de populations de microtubules cytoplasmiques, éventuellement regroupés en fonction du diamètre (Fig. S5e), ce qui suggère qu'un niveau de contrôle est disponible.

Un nombre accru de protofilaments pourrait être dû à des modifications post-traductionnelles altérées ou à l'expression d'une nouvelle isoforme de MAP ou de tubuline. Plasmodium spp. expriment une β- et deux isoformes de α-tubuline. Bien que les tubulines α1 et α2 présentent une identité de séquence d'environ 95%, il existe plusieurs substitutions d'acides aminés dans des régions clés. L'α2-tubuline, par exemple, manque de 3 acides aminés à son extrémité C-terminale (souvent une cible pour les modifications post-traductionnelles) et la région la moins conservée dans la séquence correspond à une boucle qui peut médier les interactions intra-protofilament. Ces petits changements pourraient finalement entraîner des altérations du réseau des microtubules et favoriser la formation de tubules B conduisant à des doublets et des triplés36. De plus, des études antérieures sur les isoformes de la tubuline chez l'homme ont montré que la fraction relative d'une isoforme dans un microtubule peut moduler le réseau des microtubules37, fournissant une explication possible de la plage de nombres de protofilaments observés. Bien que l'α2-tubuline soit probablement exprimée dans toutes les formes du cycle de vie, son expression relative est la plus élevée aux stades sexuels38,39. Cette isoforme n'était pas présente dans les microtubules purifiés à partir des stades asexués40, n'est pas essentielle dans les formes asexuées41 et ne peut remplacer que partiellement l'α1-tubuline dans les sporozoïtes de P. berghei42.

P. falciparum est la seule espèce de Plasmodium qui produit des gamétocytes allongés43, et il a été démontré que leurs SPMT sont polyglutamés, ce qui peut jouer un rôle dans leur stabilité28,44. Le gamétocyte en cours de maturation a une déformabilité réduite45 qui joue un rôle dans l'inhibition de la libération prématurée des gamétocytes des sites de séquestration dans la moelle osseuse, évitant ainsi la clairance splénique46. Les gamétocytes sont les plus rigides au stade IV, lorsque tous les microtubules sont assemblés. Cependant, les cellules redeviennent déformables au stade V, lorsque la majorité des SPMT ont été démontées, suggérant un lien entre la rigidité des cellules et les SPMT.

Nous nous attendons à ce que les microtubules géants soient significativement plus rigides (moins susceptibles de se plier) que la forme canonique. La transition de 13 protofilaments à 17 ou 18 protofilaments devrait augmenter considérablement la rigidité d'un microtubule individuel, car un changement de 13 à 15 protofilaments devrait entraîner une augmentation de 35% de la rigidité47. Cette rigidité accrue est mise en évidence, par exemple, dans les cellules mécanosensorielles où leurs microtubules à 15 protofilaments sont impliqués dans la mécanotransduction. Comme la périphérie des gamétocytes a une surface limitée, un nombre limité de microtubules peut s'adapter sur la surface interne de l'IMC. Par conséquent, la maximisation du nombre de microtubules ainsi que l'assemblage de microtubules plus grands et plus rigides peuvent permettre aux gamétocytes de P. falciparum de se développer dans leur forme étendue et rigide et de se développer sans être dérangés chez leurs hôtes humains jusqu'à maturité.

Les deux formes de moustiques, en revanche, ont leurs propres SPMT uniques constitués de 13 protofilaments et renforcés de manière caractéristique avec un ILH. Nos observations contribuent à une liste croissante d'organismes qui utilisent un ILH dans leur cytosquelette de microtubules, qui comprend désormais les SPMT des apicomplexans14,27 et les cils et les flagelles de certains mammifères25,26. Avec nos observations, il semble probable que l'ILH constituée de protéines de type TrxL1 et SPM1 soit conservée dans l'Apicomplexa, mais uniquement dans certaines formes de cycle de vie. Le profil d'expression de TrxL1 dans les données publiées est cohérent avec notre observation, avec sa transcription fortement régulée positivement chez les ookinètes et les sporozoïtes et très peu d'expression relative dans les stades sanguins38,48. Dans nos lignées TrxL1-GFP et SPM1-GFP, nous avons constaté des niveaux élevés d'expression dans les sporozoïtes (Fig. S2). Curieusement, chez les mammifères, il existe un homologue de TrxL1 qui se localise dans les cils pulmonaires et les flagelles de spermatozoïdes (Txl-249 de type thiorédoxine) et un homologue de SPM1 dans les axonèmes (stabilisateur des microtubules axonémiques SAXO250), ce qui suggère que l'ILH pourrait être un problème commun. caractère eucaryote.

Il a été supposé que l'ILH limite le renouvellement à l'extrémité plus des microtubules et renforce les SPMT dans les directions longitudinale (via SPM1) et transversale (TrxL1)25,26. Un mutant SPM1-null chez T. gondii avait une remise en forme réduite12. Cela n'a pas été observé dans une deuxième étude, bien que les microtubules aient été plus sensibles aux traitements chimiques lorsqu'ils manquaient SPM1 ou TrxL127. Il est évident que l'ILH se produit dans les structures locomotrices, telles que les cils, les extrémités flagellaires et les formes de glissement apicomplexes. Ainsi, nous postulons que l'ILH fournit la stabilité sans sacrifier la flexibilité, et si des ruptures se produisent, SPM1 maintient les extrémités ensemble, permettant la réparation SPMT ou l'auto-guérison. Là où seule la rigidité est requise, les gamétocytes de Plasmodium ont développé une feuille dense de SPMT avec un grand nombre de protofilaments, de doublets et de triplets.

La fonction des SPMT en tant qu'éléments du cytosquelette repose sur une connexion physique à l'IMC. En étudiant le lien entre les SPMT et l'IMC, nous avons constaté que l'orientation de rotation des SPMT contenant de l'ILH par rapport à l'IMC était définie. Étonnamment, la couture n'était pas orientée vers l'IMC. Ceci est cohérent avec et clarifie les données précédentes sur l'orientation de la couture de T. gondii14 solubilisé au détergent aplati, mais reste surprenant car la couture est la seule caractéristique de microtubule vraiment asymétrique accessible par des MAP de liaison externe. Au lieu de cela, l'ILH pourrait définir directement l'orientation de rotation. Les gamétocytes, dépourvus d'ILH, ont une polarité radiale apparemment aléatoire. Notre preuve en était la grande variance du doublet φIMC, mais au-delà de cela, il est également difficile de concilier la supertorsion des microtubules non canoniques avec un lieur ayant une préférence pour un protofilament spécifique (car différents protofilaments sont dirigés vers l'IMC comme le microtubule torsions). Nous proposons que la polarité radiale des SPMT à 13 protofilaments dans les mérozoïtes est également aléatoire, en raison de l'absence supposée d'une caractéristique asymétrique comme l'ILH.

Il existe deux mécanismes concevables pour déterminer comment l'ILH pourrait orienter les SPMT. Soit un contact direct entre un composant ILH et un MAP externe, soit en forçant les SPMT dans des sections transversales elliptiques (Fig. S1), où les angles inter-protofilaments incohérents pourraient être reconnus comme des sites de liaison. Nous avons observé de faibles densités émanant des protofilaments 11 et 12 et dans les crêtes entre les protofilaments 9 à 12 (Fig. S8). Ces densités ne sont pas cohérentes avec les MAP connues telles que la kinésine ou la doublecortine, mais la résolution de nos cartes de densité EM de symétrie C1 n'est pas suffisamment élevée pour être concluante. Il n'est pas clair s'ils correspondent à un lieur putatif SPMT-IMC, étant donné qu'ils ne sont pas orientés vers le point le plus proche sur l'IMC. Un cadre pour comprendre l'évolution de l'orientation rotationnelle asymétrique des SPMT peut être une hypothèse récemment proposée selon laquelle les SPMT proviennent d'un ancien flagelle51,52. L'orientation des ILH contenant des SPMT est à peu près cohérente avec l'orientation du tubule A dans les axonèmes par rapport à la membrane. Il faudra tester si cette polarité radiale est importante pour l'orchestration du glissement directionnel.

Les variations des structures des microtubules parmi les formes de Plasmodium posent la question évidente ; comment ces différents microtubules sont-ils nucléés ? Il a été suggéré que les SPMT avec ILH pourraient être nucléés par SPM127. TrxL1 pourrait alors fixer le nombre de protofilaments à 13 à travers la courbure de son état oligomère. Cela semble plausible isolément, mais pas à la lumière de nos nouvelles données. Il n'explique pas comment les microtubules géants des gamétocytes ou les SPMT du protofilament 13 du mérozoïte, dépourvus de l'ILH, sont nucléés. De plus, la courbure des protofilaments liés à TrxL1 s'écarte de celle d'un microtubule canonique à 13 protofilaments (Fig. S1) et il existe un espace dans l'ILH entre les protofilaments 13 et 1 où des protofilaments supplémentaires pourraient éventuellement être insérés. γTuRC est un mécanisme de nucléation peu probable car les extrémités SPMT moins ont été décapsulées dans tous les microtubules observés sous toutes les formes (Fig. S4). Bien qu'il soit possible que les coiffes γTuRC aient pu être désassemblées (la tubuline γ est exprimée dans les schizontes, par exemple53), cela serait surprenant en raison de la stabilité des microtubules de Plasmodium. Il est difficile de spéculer sur la nature de la nucléation des microtubules géants dans les gamétocytes. D'une part, on pourrait spéculer sur une nucléation γTuRC-indépendante des SPMT qui permet des nombres de protofilaments de 13 à 18. Mais d'autre part, c'est la présence d'une structure de type γTuRC sur les microtubules du fuseau, qui est néanmoins incapable de générer un microtubule homogène. population. Des données récentes suggèrent qu'au moins les SPMT initiales dans les gamétocytes sont nucléées au niveau d'une plaque centriolaire située dans la membrane nucléaire44. Il faudra encore explorer comment des microtubules de diamètre différent et notre polarité aléatoire observée des SPMT peuvent être obtenus avec ce modèle. Ensemble, ces données peuvent suggérer un nouveau mécanisme de nucléation SPMT et avec lui, une cible potentielle pour les antipaludéens.

Dans ce travail, nous révélons la métamorphose des structures de microtubules tout au long du cycle de vie de P. falciparum. Au plus haut niveau, la remarquable diversité structurelle nous oblige à réévaluer nos idées préconçues sur le microtubule canonique résultant de la dépendance excessive à un petit nombre d'organismes modèles. La haute résolution et la préservation structurelle optimale des données in situ présentées ici fournissent un cadre pour intégrer les résultats d'autres méthodes plus réductionnistes, afin d'obtenir une image complète du cytosquelette d'un organisme. Nous nous attendons à ce que plus de types de cellules soient étudiés, en utilisant ces techniques disponibles maintenant, la véritable diversité des structures de microtubules eucaryotes et leurs fonctions de niche seront plus grandes que prévu actuellement.

Des formes sanguines de P. falciparum ont été cultivées dans des globules rouges humains (O + ou B + , Universitätsklinikum Eppendorf, Hambourg, Allemagne) à 5 % d'hématocrite, 1 % d'O2, 5 % de CO2 et 94 % de N2 à 37 °C, dans du RPMI milieu complet contenant 0,5% Albumax II54.

Les schizontes ont été récoltés à l'aide de Percoll55 préchauffé à 60 %, lavés une fois avec du RPMI préchauffé, remis en suspension dans 5 % de globules rouges non infectés dans du RPMI préchauffé et cultivés pendant 3 h, jusqu'à ce que les parasites sortent et réenvahissent. Les schizontes non rompus ont été lysés avec du sorbitol à 5 ​​%. La culture restante contenait de jeunes anneaux avec une fenêtre de synchronicité de 3 h.

Des schizontes 3D7 étroitement synchronisés exprimant de manière endogène GAPM2 étiqueté GFP (protéine associée au glideosome avec de multiples étendues membranaires 256,57) ont été isolés d'une culture de 10 à 20 ml (5 à 10 % de parasitémie) à l'aide de 60 % de Percoll 55, lavés deux fois dans du pré- RPMI réchauffé et traité avec 1 µM du composé inhibiteur de PKG 2 (fourni par le Dr Mike Blackman, The Francis Crick Institute, Royaume-Uni) 58,59 et incubé pendant 6 h. Les schizontes segmentés ont été lavés une fois, puis remis en suspension dans du RPMI préchauffé sans Albumax ni rouge de phénol mais avec l'ajout de 1 µM d'E64 (Sigma) pour permettre la rupture de la vacuole parasitophore mais empêcher la rupture de la membrane des globules rouges. Cela nous a aidés à identifier les schizontes à un stade très avancé dans le SEM. Les cellules ont été maintenues au chaud et vitrifiées en une heure.

Les stades de gamétocytes ont été générés par la surexpression ciblée du facteur d'engagement sexuel GDV1 (développement des gamétocytes 1) à l'aide d'une lignée productrice de gamétocytes inductibles 3D7 (iGP) comme décrit précédemment60 surexprimant une version étiquetée GFP de la protéine complexe de membrane interne de suture PF3D7_1345600 (plasmide de57). L'expression de GDV1-GFP-DD a été obtenue par l'ajout de 2 ou 4 µM de Shield-1 à une culture de parasites contenant 2 à 3 % d'anneaux. Shield-1 a été maintenu pendant 48 heures supplémentaires jusqu'à la réinvasion. L'échantillon a été ajusté à 10% de parasitémie et cultivé en RPMI additionné de 10% de sérum humain (groupe sanguin AB+) pendant 10 jours pour permettre la maturation des gamétocytes. Pour épuiser les formes asexuées non engagées, les gamétocytes ont été traités avec 50 mM de N-acétyl-d-glucosamine (GlcNac) pendant au moins 4 jours. Le milieu de culture a été changé au moins une fois par jour sur une plaque chauffante à 37°C. Les stades II, III, IV et V des gamétocytes ont été isolés à différents moments de la maturation des gamétocytes à partir d'une culture de 20 ml en utilisant du Percoll préchauffé à 60 %. Les gamétocytes isolés ont été lavés deux fois puis remis en suspension dans du RPMI préchauffé sans albumax, sérum ou rouge de phénol et maintenus au chaud (entre 15 min et 45 min) jusqu'à immédiatement avant la congélation.

Des sporozoïtes de P. falciparum (souche : NF54-ΔPf47-5'csp-GFP-Luc : exprimant une protéine de fusion GFP-Luciférase) sous le contrôle du promoteur csp, intégration génomique, aucun marqueur de sélection61 ont été préparés à TropIQ (Nimègue, Pays-Bas) Les gamétocytes ont été nourris à des moustiques Anopheles stephensi femelles âgés de 2 jours. L'infection par les moustiques a été confirmée 7 jours après l'infection par dissection de l'intestin moyen. Sept jours après l'infection, les moustiques infectés ont reçu un repas de sang supplémentaire non infectieux pour stimuler la production de sporozoïtes. Deux semaines après l'infection, les sporozoïtes ont été isolés par dissection des glandes salivaires et expédiés à Hambourg à température ambiante.

Les ookinètes ont été produits à l'aide de la lignée P. berghei PbRFP, une lignée ANKA de P. berghei qui exprime constitutivement la RFP. Deux souris suisses femelles ont reçu une injection intrapéritonéale de 200 ul de phénylhydrazine (6 mg/ml dans du PBS) pour stimuler la réticulocytose. Deux jours plus tard, les souris ont été infectées par voie intrapéritonéale avec 20*106 iRBC PbRFP. Les souris ont été saignées trois jours après l'infection et 500 µl de sang ont été transférés dans 10 ml de milieu ookinete (RPMI additionné de 20 % (v/v) de FCS, 50 µg/ml d'hypoxanthine et 100 µM d'acide xanthurénique, ajusté à pH 7,8 – 8,0) à 19 °C. Après 22 h de culture, les cultures d'ookinetes ont été recouvertes de 5 ml de Nycodenz/PBS à 55 % et centrifugées pendant 25 min à 210 xg sans frein. L'interphase contenant les ookinètes purifiés a été recueillie, lavée dans du PBS et immédiatement congelée en plongée pour EM.

Les cellules ont été maintenues au chaud dans un bloc chauffant à 37°C à côté du congélateur plongeant. 3 µl de parasites enrichis ont été appliqués sur une grille EM UltrAufoil R1.2/1.3 300 mesh (Quantifoil) fraîchement nettoyée au plasma dans une installation à humidité contrôlée. L'excès de liquide a été rétro-transféré manuellement et les grilles ont été plongées dans un réservoir d'éthane/propane à l'aide d'un piston manuel. Les grilles ont été stockées sous azote liquide jusqu'à l'imagerie.

Les grilles ont été clipsées dans des autogrilles modifiées pour la préparation du FIB62 et chargées dans un Aquilos ou un microscope à double faisceau cryo-FIB/SEM Aquilos2 amélioré (Thermofisher Scientific). Les ensembles de carreaux de vue d'ensemble ont été enregistrés à l'aide du logiciel MAPS (Thermofisher Scientific) avant d'être recouverts par pulvérisation cathodique d'une fine couche de platine. De bons sites avec des parasites ont été identifiés pour la préparation des lamelles avant que le point coïncident entre le faisceau d'électrons et le faisceau d'ions ne soit déterminé pour chaque point par inclinaison de la scène. Avant le broyage, une couche de platine organométallique a été déposée sur les grilles à l'aide d'un GIS (système d'injection de gaz). Les lamelles ont été broyées manuellement jusqu'à moins de 300 nm dans une série progressive de courants décroissants. Le broyage a été effectué aux angles les plus bas possibles pour augmenter la longueur des lamelles dans les cellules minces. Enfin, le polissage de toutes les lamelles a été effectué en fin de séance le plus rapidement possible mais toujours dans un délai de 1h30 pour limiter la contamination par la glace par dépôt d'eau à la surface des lamelles. Avant de retirer les échantillons, les grilles ont été recouvertes par pulvérisation cathodique d'une fine couche finale de platine. Les grilles ont été stockées dans de l'azote liquide pendant un maximum de 2 semaines avant l'imagerie dans le TEM.

Les grilles fraisées FIB ont été tournées de 90 ° et chargées dans un microscope Titan Krios (Thermofisher) équipé d'un détecteur d'électrons direct K2 ou K3 et d'un filtre d'énergie (Bio-) Quantum (Gatan). Les données tomographiques ont été recueillies avec SerialEM63 avec la fente de sélection d'énergie réglée sur 20 eV. Les ensembles de données ont été collectés à l'aide du schéma d'acquisition à symétrie de dose à une plage d'inclinaison de ± 65° avec des incréments d'inclinaison de 3°. Pour tous les ensembles de données, 5 à 10 images ont été collectées et alignées à la volée à l'aide de SerialEM et la fluence totale a été maintenue à moins de 120e−/Å2. Des défocalisations entre 3 et 8 μm sous-focus ont été utilisées pour enregistrer la série d'inclinaison ».

Les cadres ont été alignés à la volée dans SerialEM ; L'estimation du CTF, le retournement de phase et la pondération de la dose ont été effectués dans IMOD64. Les séries d'inclinaison ont été alignées dans IMOD soit en utilisant le suivi des patchs, soit en utilisant des nanoparticules (probablement de l'or ou du platine) sur les surfaces des lamelles comme marqueurs fiduciaires. Les tomogrammes ont été regroupés 4x et filtrés dans IMOD ou en utilisant Bsoft65.

La SVA a été réalisée en PEET66 avec des tomographies à un binning progressivement plus faible. Les coordonnées 3D initiales (points de modèle ou coordonnées de particules) pour SVA ont été générées par interpolation entre les centres de microtubules tracés manuellement dans IMOD, en utilisant des scripts basés sur TEMPy67 et en utilisant les bibliothèques Python Numpy, Scipy et Matplotlib68,69,70. Les vecteurs entre les paires de points ont été utilisés pour définir l'orientation initiale de l'axe Y des particules (axe de pseudosymétrie des microtubules). Chaque microtubule a été traité séparément, aligné sur une référence unique (moyenne brute) générée en faisant la moyenne des particules respectives avec des orientations initiales (Fig. S9). Afin de déterminer sa polarité et le nombre de protofilaments, les rotations initiales autour de l'axe Y (appelées ici rotation φ) ont été randomisées (Fig S9, étape 2). Les particules des mêmes formes avec le même nombre de protofilaments ont ensuite été combinées pour un traitement ultérieur. La progression de la SVA a été surveillée en inspectant des modèles de broches dans UCSF Chimera (Fig. 2e) où la position et l'orientation de chaque particule étaient représentées par une paire de marqueurs. Cela nous a permis, par exemple, d'identifier et de supprimer les valeurs aberrantes de la géométrie linéaire. Les particules ont été élaguées si elles se chevauchaient avec d'autres, avaient un faible coefficient de corrélation croisée ou s'éloignaient trop de leurs positions initiales. Les cartes SPMT ont été affinées à l'aide de facteurs B arbitraires à l'aide de Bsoft65.

Après avoir déterminé la polarité relative, l'étape nécessaire pour combiner consiste à trouver la rotation relative φ (rotation autour de l'axe de symétrie) entre les microtubules individuels. Cela pourrait être fait en alignant chaque particule individuelle sur une référence commune, mais entraînerait un grand nombre d'erreurs en raison du faible rapport signal sur bruit. Nous avons développé une méthode analogue à celle de Zabeo et al., 25 où les volumes moyens des microtubules sont alignés ensemble afin de trouver leur rotation relative φ (Fig. S9 étape 4). Ces rotations φ ont ensuite été appliquées à leurs particules respectives et alignées sur une référence commune. La SVA a ensuite été réalisée avec des volumes regroupés 4 et 2 fois. Seules les données sur les sporozoïtes étaient alignées sur les volumes non regroupés ; l'étape finale consistait à remplacer les volumes reconstruits avec l'ensemble des tilts par des volumes reconstruits avec des tilts compris entre ±24°. Aucune recherche de rotation n'a été effectuée avec la plage d'inclinaison restreinte. La carte C1 EM résultante était anisotrope autour de l'axe de pseudosymétrie en raison d'une distribution inégale des orientations de rotation des microtubules. Pour résoudre ce problème, les particules ont été séparées en classes par orientation et les particules ayant les coefficients de corrélation croisée les plus faibles dans les classes les plus abondantes ont été supprimées. Cela a réduit le nombre de particules de 24028 à 13263 dans les sporozoïtes et de 8377 à 1851 dans les ensembles de données d'ookinete.

Environ 200 microtubules de 25 tomogrammes ont été traités individuellement, avec des rotations φ initiales aléatoires. Les données ont ensuite été classées manuellement par numéro de protofilament, tournées à la même polarité et alignées avec les volumes regroupés 4 et 2 fois. Les paramètres hélicoïdaux ont été mesurés directement à l'aide des moyennes de classe, à l'exception des classes de 13 et 15 protofilaments où les sous-unités de tubuline n'ont pas été résolues et les paramètres publiés ont été utilisés (tableau S2)71. Une symétrie hélicoïdale a été appliquée, suivie d'un alignement SVA.

Les doublets SPMT ont été traités d'une manière analogue aux données sur les ookinètes et les sporozoïtes, où les volumes moyens ont été utilisés pour déterminer les rotations φ relatives. Les SPMT avec différents nombres de protofilaments dans les tubules A et B ont été combinés ensemble, ce qui a donné un volume moyen d'ensemble.

Les particules ont été divisées en deux moitiés (particules paires et impaires). Des décalages de coordonnées aléatoires allant jusqu'à ± 2 nm et des décalages angulaires aléatoires allant jusqu'à ± 3 ° ont été ajoutés à chaque particule et les paramètres résultants ont été utilisés pour générer à nouveau une moyenne brute pour chaque demi-ensemble de données. L'alignement des deux moitiés a ensuite été effectué indépendamment avec des volumes regroupés puis non regroupés, en suivant la même procédure que pour l'ensemble des données. La corrélation en coquille de Fourier a été mesurée à l'aide de Bsoft.

Les cartes EM et les modèles atomiques ont été visualisés avec UCSF (Université de Californie à San Francisco) Chimera72 ou UCSF ChimeraX73. Les sections de calcul ont été générées dans IMOD.

ClustalOmega74,75 a été utilisé pour aligner les séquences de protéines TrxL1 et JalView a été utilisé pour la visualisation76. Les couleurs sont basées sur la coloration ClustalX.

La segmentation a été effectuée manuellement dans IMOD, à l'aide d'outils de dessin suivis d'une interpolation linéaire. Les modèles résultants ont été utilisés pour extraire des volumes segmentés. Les SPMT, les conoïdes ookinètes et les sporozoïtes APR ont été rétro-tracés : les volumes moyens ont été placés dans des volumes 3D en utilisant les coordonnées déterminées par SVA. Les particules SPMT et APR ont été ajustées par spline pour lisser les erreurs d'alignement pour la visualisation. Les volumes segmentés et rétro-tracés ont été visualisés à l'aide de l'UCSF ChimeraX73.

Les tomogrammes ont été filtrés passe-bande à l'aide de Bsoft. Les segmentations des tomogrammes filtrés ont été guidées par un algorithme de vote de tenseur utilisant TomoSegMemTV77,78. Les paramètres ont été optimisés pour chaque ensemble de données, respectivement. Les clusters contenant les segmentations IMC ont été extraits manuellement par analyse visuelle. Les clusters ont ensuite été convertis en un nuage de points 3D et traités ultérieurement à l'aide de la bibliothèque Open3D78. Une analyse statistique des valeurs aberrantes a été utilisée pour éliminer le bruit excessif des segmentations. Par la suite, l'algorithme DBSCAN a été utilisé pour séparer les sections de membrane individuelles et le côté extérieur de l'IMC a été sélectionné manuellement pour les mesures de distance ultérieures. L'angle φIMC a été mesuré entre deux vecteurs pour chaque particule SPMT : un vecteur de l'axe X de la particule SPMT et un vecteur allant du centre de la particule à la coordonnée IMC segmentée la plus proche (à peu près équivalente au vecteur normal IMC coupant la particule SPMT). Les particules à l'extérieur des patchs membranaires segmentés ont été exclues. Les mesures des microtubules individuels ont été réduites à une valeur médiane pour le traçage et les analyses statistiques.

L'exigence d'une densité de membrane claire pour la segmentation automatisée a considérablement réduit le nombre de microtubules disponibles pour l'analyse. Ainsi, en raison de la rareté des SPMT dans les mérozoïtes, des doublets dans les gamétocytes et des extrémités négatives dans les ookinetes, un petit nombre de tomogrammes ont été segmentés manuellement dans IMOD.

Initialement, le modèle SPMT de T. gondii (PDB 7MIZ) a été adapté à la carte SPMT EM du sporozoïte de P. falciparum en tant que corps rigide dans Chimera72, l'ajustement a ensuite été visualisé dans ChimeraX73. L'ajustement résultant était sans ambiguïté avec TgTrxL2 (qui n'est pas exprimé dans Plasmodium mais fait partie de Toxoplasma ILH) à l'extérieur et les chaînes protéiques restantes à l'intérieur de la carte. En raison de la différence d'ellipticité entre les cartes de P. falciparum et de T. gondii, les protofilaments et les demi-arcs TrxL1/SPM1 ont été installés en tant qu'unités séparées. La prédiction structurelle de PfTrxL1 (https://alphafold.ebi.ac.uk/entry/Q8I2W0)79 a été alignée sur TgTrxL1 (PDB 7MIZ) à l'aide de matchmaker80 dans ChimeraX.

Les angles inter-protofilaments ont été déterminés en mesurant l'angle entre les atomes Cα de la même paire de résidus dans les protofilaments voisins. Des valeurs médianes d'environ 200 mesures ont été utilisées.

Le marquage endogène a été effectué essentiellement comme décrit avant d'utiliser l'intégration à croisement unique81. Comme SPM1 et TrxL1 montrent une longueur globale de gène inférieure à 1 kilobase, l'ensemble du cadre de lecture ouvert a été amplifié à partir de l'ADN génomique de type sauvage PbANKA. Le fragment d'ADN résultant a été cloné dans le vecteur pL18 82 en utilisant les sites de restriction EcoRI et BamHI. L'amorce inverse codée pour six alanines qui ont été utilisées comme lieur. Le vecteur pL18 héberge le gène hDHFR pour une sélection positive en utilisant le médicament pyriméthamine. Avant la transfection, le vecteur a été linéarisé en utilisant SwaI (SPM1) et BsmI (TrxL1), respectivement, suivi d'une précipitation à l'éthanol. Tous les oligonucléotides utilisés pour générer des fragments d'ADN ainsi que ceux utilisés pour le génotypage des PCR sont répertoriés dans le tableau 1.

Les vecteurs pL18-SPM1-GFP/pL18-TrxL1-GFP linéarisés ont chacun été transfectés dans une souche ANKA de P. berghei non modifiée en utilisant des protocoles standards83. Les parasites qui ont intégré la construction d'ADN souhaitée ont été sélectionnés par administration orale de pyriméthamine (0,07 mg/ml) via l'eau potable de la souris un jour après la transfection. Une fois que les souris ont montré entre 1 et 3 % de globules rouges infectés, le sang a été prélevé par ponction cardiaque sur des souris anesthésiées (100 mg/kg de kétamine et 3 mg/kg de xylazine, Sigma-Aldrich). Pour le stockage permanent de la lignée parasitaire, des aliquotes de 100 µl de sang total mélangés à 200 µl de solution de congélation (10 % de glycérol dans une solution d'Alsever, Sigma-Aldrich) ont été stockées dans de l'azote liquide.

Pour vérifier l'intégration correcte, l'ADN génomique a été isolé du sang total et testé pour l'intégration correcte de la construction par génotypage PCR. Pour cela, les érythrocytes ont d'abord été lysés dans 1,5 ml de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) contenant 0,03 % de saponine. Après centrifugation et deux étapes de lavage, l'ADN génomique a été isolé à l'aide du kit Blood and Tissue (Qiagen Ltd) selon le protocole du fabricant. Les parasites issus de ces transfections résultant en des populations mixtes (parentales) ont été utilisés pour les infections par les moustiques.

Les plasmides et les oligonucléotides ont été conçus à l'aide de la version 3.2.1 du logiciel SnapGene (Insightful Science, disponible sur snapgene.com). Les images ont été analysées avec Fiji (Version : 2.0.0 rc 64/1.51 s)84.

Des stocks de parasites congelés (non clonaux) ont été décongelés et directement injectés par voie intrapéritonéale (100 à 150 µl) à une souris (souris suisses femelles âgées de 6 à 8 semaines) avec l'infection surveillée par des frottis sanguins. Une fois que la souris infectée a atteint 2 à 3 % de globules rouges infectés, la souris a été anesthésiée (100 mg/kg de kétamine et 3 mg/kg de xylazine, Sigma-Aldrich), saignée et 20 millions de parasites transférés dans deux souris receveuses naïves par injection intrapéritonéale. Trois jours après le transfert de sang frais, les souris ont été anesthésiées (120 mg/kg de kétamine et 16 mg/ml de xylazine) et placées dans une cage contenant environ 200 moustiques femelles Anopheles stephensi, qui ont été affamés pendant 3 à 5 h en retirant les tampons de sucre et de sel. . Les moustiques ont été autorisés à se nourrir de souris pendant 15 min à 30 min. Après l'infection, les moustiques ont été maintenus à 21 °C et 70 % d'humidité.

Les sporozoïtes des glandes salivaires ont été isolés au jour 19 après le repas de sang des moustiques. A cet effet, les glandes salivaires ont été disséquées sur de la glace dans du RPMI et broyées au pilon. Par la suite, le tube a été rempli jusqu'à 1 ml de RPMI et la solution a été soigneusement recouverte de 3 ml d'Accudenz à 17 % (coopération chimique et scientifique précise). Une centrifugation à 1600 xg pendant 20 min à température ambiante a séparé les sporozoïtes des débris cellulaires. L'interphase contenant les sporozoïtes a été recueillie (volume total de 1,4 ml) et les sporozoïtes ont été centrifugés pendant 3 minutes à 100 xg (Thermo Fisher Scientific, Biofuge primo). La remise en suspension des sporozoïtes en culot dans du RPMI contenant 3 % d'albumine de sérum bovin (ROTH) a donné des sporozoïtes activés. Le mélange résultant a été transféré dans un puits d'une plaque à 96 puits à fond optique (Thermo Fisher Scientific) et la plaque a été centrifugée pendant 3 min à 200 xg (Multifuge S1-R, Heraeus). Les sporozoïtes ont été imagés à l'aide d'un microscope à épifluorescence (CellObserver, Zeiss) et d'un objectif 25 × (NA 0,8, eau) avec une exposition de 80 ms. Les images ont été prises jusqu'à 1 h après l'activation des sporozoïtes.

Des images de fluorescence de parasites vivants ont été prises sur un microscope à fluorescence Leica D6B équipé d'une caméra Leica DFC9000 GT et d'un objectif à huile Leica Plan Apochromat 60× ou 100× / 1,4. Le contraste et les intensités ont été ajustés linéairement pour présenter des formes de parasites claires à l'aide de Fidji et les images recadrées ont été assemblées en une composition de cellules pour la figure 1 à l'aide d'Adobe Illustrator CC 2021.

Cinq préparations de gamétocytes de P. falciparum ont été générées dont six grilles ont été imagées, cinq préparations de schizontes de P. falciparum ont été générées dont six grilles ont été imagées, deux préparations de sporozoïtes de P. falciparum ont été générées dont quatre grilles ont été imagées et deux préparations d'ookinetes de P. berghei ont été générés dont trois grilles ont été imagées.

De plus amples informations sur la conception de la recherche sont disponibles dans le résumé des rapports sur le portefeuille Nature lié à cet article.

Les moyennes de sous-volume générées dans cette étude ont été déposées dans l'EMDB sous les codes d'accession Sporozoite MT (EMD-15532), Gametocyte MTs : 13pf (EMD-15534), 14pf (EMD-15535), 15pf (EMD-15536), 16pf ( EMD-15537), 17pf (EMD-15538), 18pf (EMD-15539). Les données de mesure de distance générées dans cette étude sont fournies dans le fichier Source Data. Toutes les souches et plasmides sont disponibles sur demande. Les données sources sont fournies avec ce document.

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Nous tenons à remercier les installations CSSB Cryo-EM et ALFM pour leur soutien. Nous remercions Till Voss pour les parasites 3D7-iGP, TropIQ pour avoir fourni les sporozoïtes de P. falciparum et Andrew Waters et Katie Hughes pour avoir partagé la lignée PbRFP. Merci à Lindsay Baker pour ses commentaires critiques sur les résultats et à John Heumann et Carolyn Moores pour leurs discussions et conseils utiles. Merci à la communauté Stackoverflow d'être un référentiel de connaissances apparemment sans fond et qui rétablit la santé mentale. Ce travail a été financé par : la bourse postdoctorale longue durée HFSP LT000024/2020-L (JLF), Infrastructures de lutte contre les maladies à transmission vectorielle (Infravec2) financées par le programme européen Horizon 2020 (convention de subvention n° 731060) (JLF), Programme postdoctoral interdisciplinaire de l'EMBL sous Marie Curie Actions COFUND MSCA-COFUND-FP (numéro de convention de subvention : 847543) (MS), Centre allemand de recherche sur les infections, DZIF (FH), DFG-FR 2140/10-1 (AMB), DFG research réseaux SFB 1129, SPP 2332 et subvention FR 2140/10-1 (FF), CSSB KIF-002 (TWG et KG), réseaux de recherche DFG SPP 2225 (TWG), subventions Wellcome Trust 107806/Z/15/Z et 209250/ Z/17/ Z (KG), subvention BMBF 05K18BHA (KG), DFG INST 152/ 772-1, 774-1, 775-1, 777-1 FUGG (installation CSSB cryoEM).

Financement Open Access activé et organisé par Projekt DEAL.

Josie L. Ferreira

Adresse actuelle : Institute of Structural and Molecular Biology, Birkbeck, University of London, Londres, Royaume-Uni

Ces auteurs ont contribué à parts égales : Josie L. Ferreira, Vojtěch Pražák.

Centre de biologie des systèmes structurels, Hambourg, Allemagne

Josie L. Ferreira, Vojtěch Pražák, Daven Vasishtan, Marc Siggel, Emma Pietsch, Jan Kosinski, Tim W. Gilberger et Kay Grünewald

Institut Leibniz de virologie (LIV), Hambourg, Allemagne

Josie L. Ferreira, Vojtech Pražák, Daven Vasishtan & Kay Grünewald

Institut Bernhard Nocht de médecine tropicale, Hambourg, Allemagne

Josie L Ferreira, Emma Pietsch & Tim W Gilberger

Division de biologie structurale, Wellcome Centre for Human Genetics, Université d'Oxford, Oxford, Royaume-Uni

Vojtech Pražák, Daven Vasishtan & Kay Grünewald

Laboratoire européen de biologie moléculaire, Hambourg, Allemagne

Marc Siggel et Jan Kosinski

Parasitologie intégrative, Centre des maladies infectieuses, Faculté de médecine de l'Université de Heidelberg, Heidelberg, Allemagne

Franziska Hentzschel, Annika M. Binder & Friedrich Frischknecht

Centre allemand de recherche sur les infections, site partenaire DZIF Heidelberg, Heidelberg, Allemagne

Franziska Hentzschel et Friedrich Frischknecht

Université de Hambourg, Hambourg, Allemagne

Emma Pietsch, Tim W. Gilberger et Kay Grünewald

Unité de biologie structurale et computationnelle, EMBL, Heidelberg, Allemagne

Jan Kosinski

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Parasites au stade sanguin cultivés JLF et EP, parasites au stade moustique préparés AMB et FH. AMB a généré des lignées transgéniques de P. berghei et réalisé des expériences de localisation de fluorescence. JLF a effectué une microscopie à fluorescence, une préparation de grille EM, un broyage FIB et une collecte de données par microscopie électronique. JLF et VP ont effectué le traitement des données de tomographie, la moyenne des sous-volumes et l'analyse de la polarité. VP et DV ont effectué une analyse supplémentaire sur les données de tomographie, y compris l'analyse d'ellipticité et l'ajustement. VP et MS ont effectué une analyse de distance et d'angle dans les données de tomographie. JLF, VP et MS ont effectué une segmentation par tomographie. JLF, VP, AMB et EP ont préparé des chiffres. JK, FF, TWG et KG ont supervisé le projet. JLF et VP ont écrit le texte original du manuscrit et il a été révisé et édité par JLF, VP, DV, MS, FH, EP, JK, FF, TWG, KG.

Correspondance avec Kay Grünewald.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

Pour les expériences in vivo, y compris la propagation des parasites et les infections par les moustiques, des souris suisses femelles âgées de 8 à 10 semaines obtenues des laboratoires Janvier ont été utilisées. Toutes les expérimentations animales ont été réalisées conformément aux réglementations européennes concernant la catégorie B FELASA et les directives standard GVSOLAS. Les expérimentations animales ont été approuvées par les autorités allemandes (Regierungspraesidium Karlsruhe, Allemagne), § 8 Abs. 1 Tierschutzgesetz (TierSchG) sous la licence G-111/20 et ont été réalisées conformément aux réglementations nationales et européennes.

Nature Communications remercie Andreas Hoenger, Leann Tilley et Li-Av Segev Zarko pour leur contribution à l'examen par les pairs de ce travail. Les rapports des pairs examinateurs sont disponibles.

Note de l'éditeur Springer Nature reste neutre en ce qui concerne les revendications juridictionnelles dans les cartes publiées et les affiliations institutionnelles.

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Réimpressions et autorisations

Ferreira, J.L., Pražák, V., Vasishtan, D. et al. Variable microtubule architecture in the malaria parasite. Nat Commun 14, 1216 (2023). https://doi.org/10.1038/s41467-023-36627-5

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Reçu : 07 novembre 2022

Accepté : 09 février 2023

Publié: 03 mars 2023

DOI : https://doi.org/10.1038/s41467-023-36627-5

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